本站原创2.内蒙古包钢医院老年保健科，内蒙古包头 014010
[摘要] 目的 研究中国北方汉族群体载脂蛋白E（ApoE）基因多态性与2型糖尿病患者血脂水平的关联。 方法 选择2型糖尿病患者200例作为病例组，健康个体210例作为对照组，采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术检测ApoE基因型，全自动生化分析仪检测血清总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平。 结果 病例组ε3/4基因型分布频率显著高于对照组（36.50%比22.38%，χ2=9.864，P<0.05）；病例组携带ε3/4基因型的患者血清TC、TG和LDL-C水平高于对照组携带ε3/4基因型者[TC：（6.02±0.98） mmol/L比（4.87±0.97）mmol/L，t=6.301，P<0.05；TG：（2.04±0.42）mmol/L比（1.55±0.54）mmol/L，t = 5.568，P<0.05；LDL-C：（2.81±0.53）mmol/L比（2.36±0.58）mmol/L，t =4.500，P<0.05），HDL-C水平低于对照组[（1.16±0.47）mmol/L比（1.69±0.56），t =5.579，P<0.05]；病例组中携带ε3/4基因型患者脂代谢异常程度高于其他基因型，差异均具有统计学意义（P<0.05）。 结论 ApoEε3/4基因型与2型糖尿病血脂水平升高及发病有关。[关键词] 2型糖尿病；载脂蛋白E；基因多态性；脂代谢
[] A [文章编号] 1673-7210（2013）11（b）-0017-04
The relationship between apolipoprotein E polymorphi and dyslipidemia in patients with type 2 diabetes
GE Biao 1 ，2 CHEN Ji2 TIAN Gaisheng2 LI Qinxue 2 Alatangaole Damirin1
1.College of Life Sciences， Inner Mongolia University， Inner Mongolia Autonomous Region， Hohhot 010021， China； 2.Department of Aged Health Care， Inner Mongolia Baogang Hospital， Inner Mongolia Autonomous Region， Baotou 014010， China
[Abstra
源于：毕业论文总结www.shuoshilunwen.com
ct] Objective To evaluate the relationship between apolipoprotein E （ApoE） gene polymorphi and plaa lipid of patients with type 2 diabetes in the northern Han Chinese population. Methods 200 patients with diabetes （diabetes group） and 210 healthy controls （control group） were enrolled. ApoE genotype was determined by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphi （PCR-RFLP）. The total cholesterol （TC）， triglyceride （TG）， low density lipoprotein-cholesterol （LDL-C） and high density lipoprotein-cholesterol （HDL-C） levels were tested with the automatic biochemical analyzer. Results The ε3/4 genotype frequency in diabetes group was higher than that in control group （36.50% vs 22.38%， χ2=9.864， P<0.05）. The levels of serum TC， TG and LDL-C in diabetes group with ε3/4 were higher than those in control group [TC： （6.02±0.98） mmol/L vs （4.87±0.97） mmol/L， t=6.301， P<0.05； TG： （2.04±0.42） mmol/L vs （1.55±0.54） mmol/L， t = 5.568， P<0.05； LDL-C： （2.81±0.53） mmol/L vs （2.36±0.58） mmol/L， t =4.500， P<0.05]， while the level of HDL-C in diabetes group with ε3/4 were lower than those in control group [（1.16±0.47） mmol/L vs （1.69±0.56） mmol/L， t =5.579， P < 0.05]. Metabolic disorders were more serious in diabetes group with ε3/4 than the other genotypes， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion The ApoE ε3/4 genotype is related to the type 2 diabetes and abnormal lipid metaboli. [Key words] Type 2 diabetes； Apolipoprotein E； Gene polymorphi； Lipid metaboli[作者简介] 葛彪（1978.5-），男，硕士研究生；研究方向：糖尿病病因学。
[通讯作者] 阿拉坦高勒，男，博士，教授；研究方向：生物化学与分子生物学。
2型糖
原创论文www.shuoshilunwen.com
尿病是多种致病因子作用于机体导致的胰岛功能减退与胰岛素抵抗，进而引发糖、脂肪、蛋白质及电解质代谢紊乱综合征，该病以其高发病率、高致残致死率及发病年龄年轻化而备受关注。2型糖尿病病因学涉及遗传因素、免疫功能紊乱、微生物感染、毒素、自由基及精神刺激等多方面。近年来，该病的遗传学说被广泛认可并深入研究。大量临床实践与病例对照研究显示，2型糖尿病具有家族聚集倾向，有患者的家族其亲属发病率较正常人群显著增高；而在遗传学方面已经克隆或在染色体上定位了诸多易感基因。载脂蛋白E（Apolipoprotein E，ApoE）是已被证实的疾病易感基因之一。本研究以中国北方汉族健康者与2型糖尿病患者为受试对象，对上述人群ApoE基因型及血脂水平进行分析，以期阐明具有区域特色的ApoE基因多态性与2型糖尿病血脂水平及发病的相关性。
1 对象与方法
1.1 主要试剂
PCR聚合酶购自北京康为世纪生物科技有限公司；限制性内切酶Hha Ⅰ购自大连宝生物工程有限公司；蛋白酶K购自Sigma公司；其余分析纯试剂均购自Amresco公司；PCR引物委托上海生工生物工程公司合成。1.2 受试对象
经我院委员会批准，选择2012年1月～2013年3月在我院住院治疗的2型糖尿病患者作为病例组，所有病例均符合世界卫生组织关于2型糖尿病的诊断标准，同时选取我院门诊体检健康个体作为对照组。病例组200例，男115例，女85例，平均年龄（48.9±9.9）岁；对照组210例，男118例，女92例，平均年龄（49.4±9.7）岁。两组的性别及年龄构成差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。所有受试对象均于采集血液前签署知情同意书。1.3 样品准备
所有受试对象均空腹12 h后于次日清晨抽取静脉血2 mL，枸橼酸钠抗凝。4℃下1300 r/min 离心15 min，分离血清与白细胞，置于-80℃超低温冰箱保存备用。血清进行血脂水平检测，白细胞采用常规SDS-蛋白酶K/酚-氯仿法提取基因组DNA。1.4 血脂水平检测
采用Olympus AU400 全自动生化分析仪进行血脂水平检测，检测指标包括：总胆固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyeride，TG）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）。1.5 ApoE基因多态性分型检验
采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphi， PCR-RFLP）技术对ApoE基因行多态性分型检验，上游引物：5'-AACAACTGACCCCGGTGGCG-3'；下游引物：5'-ATGGCGCTGAGGCCGCGCTC-3'。PCR反应体系总体积20 μL，含ddH2O 7.4 μL、2×Es Taq MasterMix 10.0 μL、10 μmol/L上下游引物各0.3 μL、50 ng/μL基因组DNA 2.0 μL。PCR反应在TaKaRa的TP650扩增仪上进行，循环参数如下：94℃ 2 min；94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 30 s，循环35次；72℃ 2 min延伸。取PCR产物2.0 μL，0.5 μL限制性内切酶Hha Ⅰ（10 U/μL）于37℃酶切2 h，酶切产物经10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，Genefinder显色，通过紫外凝胶成像系统观察结果并对ApoE基因型进行分析。1.6 统计学方法
应用 SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。2 结果
2.1 病例组与对照组血脂水平比较
病例组血清TC、TG、LDL-C水平高于对照组，HDL-C水平低于对照组，差异均具有统计学意义（P<0.05）。见表1。表1 病例组与对照组血脂水平比较（mmol/L，x±s）
注：与对照组比较，*P<0.05；TC：总胆固醇；TG：三酰甘油；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇
2.2 病例组与对照组ApoE基因型比较
ApoE基因扩增产物经HhaⅠ酶切后电泳分离共鉴定出6种基因型：ε2/2型为91、83 bp；ε3/3型为91、48、35 bp；ε4/4型为72、48、35 bp；ε2/3型为91、83、48、35 bp；ε2/4型为91、83、72、48、35 bp；ε3/4型为91、72、48、35 bp。在病例组与对照组中皆以ε3/3型频率最高，ε3/4型及ε2/3型次之，ε2/2型、ε2/4型及ε4/4型很低。两组间ε3/4型分布频率差异有统计学意义（χ2=9.864，P < 0.05）。见表2。2.3 不同ApoE基因型携带者血脂水平比较 对病例组与对照组基因型分布频率较高个体（ε2/3、ε3/3、ε3/4）的血脂水平进行统计学分析，发现病例组中携带ε3/4型的患者血清TC、TG和LDL-C水平高于对照组，而HDL-C水平低于对照组，两组比较差异有统计学意义（P < 0.05）；病例组中携带ε2/3型及ε3/3型的患者与对照组血脂水平比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表3。
表3 病例组与对照组同种ApoE基因型血脂水平比较（mmol/L，x±s）
注：与对照组同基因型比较，*P < 0.05；与病例组ε3/3基因型比较，#P < 0.05；与病例组ε2/3基因型比较，△P < 0.05；TC：总胆固醇；TG：三酰甘油；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇
3 讨论
ApoE基因位于第19号染色体长臂13.2区（l9q13.2），全长3.7 kb，包含4个外显子和3个内含子，编码产物为299个氨基酸组成的单链多态糖蛋白。其中，编码第112位与第158位氨基酸的碱基由于单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphi，SNPs）而导致编码产物的差异，已经发现人群中存在ε2、ε3、ε4 3种等位基因，ε2/2、ε2/3、ε2/4、ε3/3、ε3/4、ε4/4 6种基因型。ε4编码第112位及第158位均为精氨酸，子为CGC，可被 HhaⅠ识别（GCGC）并酶切；ε2编码第112位及第158位均为半胱氨酸，子为TGC，不构成HhaⅠ酶切位点；ε3编码第112位为半胱氨酸而第158位为精氨酸。因此，ApoE基因型可根据HhaⅠ酶切扩增产物的电泳图谱进行鉴定。
ApoE蛋白主要由肝脏合成并代谢，是血浆主要载脂蛋白之一，在血浆脂蛋白代谢、组织修复、抑制血小板聚集、免疫调节和抑制细胞增殖等病理生理过程均发挥重要作用。ApoE基因与代谢性疾病及其并发症[1-3]、心血管疾病[4-5]、脑血管病变及神经退行性疾病[6-7]发病密切相关，基因多态性分型对预测相关疾病发病风险，推测疾病的发病机制及对其预后进行评估具有重要的现实意义。ApoE基因的疾病相关性被国内外众多学者广泛关注，研究结果的差异提示种族与地域特异性是疾病易感基因研究中不容忽略的因素[8-10]。本研究立足于中国北方汉族群体，研究数据显示：在上述人群中，2型糖尿病患者ApoE ε3/4型分布频率显著高于健康对照组，提示ε3/4型是糖尿病的易感基因型，可能参与该病的发病。
在中国人群中，分布频率最高的ε3等位基因被认为是野生型，而分布频率较低的ε2与ε4等位基因则被称为变异型。不同等位基因的ApoE蛋白表达量及受体亲和力显著不同，是影响血脂水平最显著的遗传因素，几乎涉及机体所有脂蛋白的代谢[11-12]。为进一步揭示ApoE基因型造成的血脂水平差异以及与2型糖尿病的相关性，本研究对检出率较高的ε2/3、ε3/3及ε3/4基因型进行血脂水平分析。研究数据显示：病例组ε3/4型携带者血清TC、TG及LDL-C水平高于对照组，HDL-C水平低于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）；在病例组中，ε3/4型携带者血清TC、TG及LDL-C水平高于ε2/3型及ε3/3型携带者，而HDL-C水平低于ε2/3型及ε3/3型携带者，差异具有统计学意义（P<0.05）；在对照组中，ε3/4型携带者血脂水平较ε2/3型及ε3/3型携带者增高，但差异无统计学意义（P>0.05）。上述研究结果提示，ApoE基因型可影响个体间血脂水平，ε3/4型对血脂水平影响较大并与糖尿患者血脂水平异常密切相关。
本研究首次报道中国北方汉族人群ApoE基因多态性与2型糖尿病及血脂水平的相关性，证实ApoE是糖尿病的易感基因，ε3/4型可导致糖尿患者血脂水平异常并进一步参与该病发病。本次研究数据补充了具有中国区域特色的遗传学数据，并为整体研究ApoE基因结构及功能提供有价值的基础数据。不仅如此，本研究数据将为综合分析探讨2型糖尿病的遗传学发病机制提供重要线索，对该病的预防、临床前诊断、治疗及预后具有重要的指导意义。
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（收稿日期：2013-08-02 本文编辑：程 铭）[3]