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试述菌丝克隆白色念珠菌菌丝壁蛋白1N端片段克隆与原核表达结论

最后修改时间：2024-04-13 收藏本文 点赞:23971 浏览:101039 作者：用户投稿原创标记本站原创
摘要：目的随着糖皮质激素、免疫抑制剂和广谱抗菌药物、介入性治疗等诊疗技术的广泛运用，从及艾滋病患者的增多，真菌感染的发病率日趋升高。调查显示侵袭性白色念珠菌病占所有深部真菌感染的比例一直高达70%-85%。尽管有抗真菌药物的治疗，但由于早期诊断困难，侵袭性白色念珠菌病往往预后极差。白色念珠菌是一种既能从酵母形态又能从菌丝形态生长的真菌，产生菌丝是其具有致病力的一种体现，Staab等首先发现白色念珠菌菌丝壁蛋白1（hyphal wall protein1, Hwp1），探讨显示，Hwp1具有菌丝特异性及抗原性和种属特异性特征，使其在侵袭性念珠菌病诊断中可能发挥重要意义。本探讨拟构建白参考生产管理色念珠菌的菌丝壁蛋白1(Hwp1) N端片段的重组质粒，在大肠杆菌中诱导表达重组蛋白。为后续研究Hwp1抗原、抗系统统在诊断侵袭性白念珠菌的意义和地位奠定基础。办法1.目的基因的制备：利用酵母基因组提取试剂盒白色念珠菌基因组DNA，经PCR办法扩增获得目的基因。2.目的基因的克隆：将目的基因克隆至pMD18-T载体上，通过蓝白筛选法获得克隆成功的质粒，经PCR法及双酶切法鉴定目的基因后测序进行检验。3.重组Hwp1的N端片段的诱导表达：将目的基因连接至表达载体pET28a(+)，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，提取质粒进行PCR、双酶切法鉴定，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷酶(IPTG)诱导、超声裂解菌体、SDS-PAGE电泳观察结果，获得重组表达的目的蛋白。结果1.经PCR办法克隆出全长为500bp的Hwp1基因的N端的核苷酸序列与GenBank中公布的序列基本同源。2.成功制备了重组质粒pMD18-T-Hwp1及pET28a(+)-Hwp1，PCR及双酶切法鉴定结果。3.构建了含重组质粒pET28a(+)-Hwp1的大肠杆菌工程菌，经IPTG诱导能高效表达目的蛋白。结论1.成功构建了白色念珠菌基因Hwp1基因N端序列的原核表达质粒pET28a(+)-Hwp1。2．Hwp1基因N端序列的原核表达质粒在大肠杆菌BL-21中成功表达融合蛋白，为进一步探讨其在诊断白色念珠菌病中的意义奠定了基础。关键词：白色念珠菌论文菌丝壁蛋白1论文克隆论文表达论文
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    缩略词表5-6

    中文摘要6-8

    Abstract8-10

    前言10-12

    材料与办法12-25

    结果25-28

    讨论28-31

    结论31-32

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